Para evitar estas presiones renunció a la herencia familiar y se trasladó en 1212 al monasterio de Santa Cruz de Coimbra, importante centro de enseñanza religiosa que contaba con una gran biblioteca. En este otro lugar recibió la influencia de la escuela teológica de San Víctor (París) a través de profesores que habían estudiado allí. Tampoco en Coimbra encontró tranquilidad, pues el monasterio se vio afectado por el enfrentamiento entre el rey Alfonso II de Portugal y el papa Inocencio III: su propio prior, Juan, fue excomulgado por apoyar al monarca portugués.

Hacia 1219, fecha en que probablemente era ya sacerdote, conoció a la pequeña comunidad franciscana de Coimbra, establecida poco antes en el eremitorio de Olivais, y se sintió atraído por su modo de vida fraterno, evangélico y en pobreza. Cuando poco después llegaron a su monasterio restos de los primeros mártires franciscanos, muertos en Marrakech, decidió ingresar en la nueva orden, que a causa de su reciente creación aún estaba poco extendida y carecía del prestigio que alcanzaría más adelante. Fray Juan Parenti, provincial de España, presidió la sencilla ceremonia de toma de hábito franciscano (verano de 1220), en la que cambió el nombre de Fernando por el de Antonio (el eremitorio de Olivais estaba dedicado a San Antonio Abad), símbolo de su cambio de vida.

Tras un breve noviciado, e impulsado por el ejemplo de los mártires franciscanos, parece que en otoño de ese mismo año embarcó hacia Marruecos junto con otro hermano de orden, fray Felipe de Castilla, para alcanzar él mismo el martirio. Sin embargo, al poco de desembarcar contrajo la malaria, enfermedad que le dejaría secuelas para toda la vida; convaleciente todo el invierno, se vio obligado a abandonar el país.

Su intención era ahora llegar a las costas españolas y desde ellas volver por tierra a Portugal, pero una tempestad llevó el barco en que viajaba hasta Sicilia. Permaneció algún tiempo en Milazzo (costa noreste de la isla), donde había una comunidad franciscana, para completar su recuperación. En junio de 1221 asistió al capítulo de su orden en Asís ("capítulo de las Esteras", que convocó a tres mil franciscanos); allí conoció a San Francisco de Asís y decidió no regresar a Coimbra para ponerse al servicio de fray Gracián, provincial de la Romaña (circunscripción franciscana que abarcaba todo el norte de Italia).

Fray Gracián lo envió durante un año al eremitorio de Montepaolo (cerca de Forli) para que se fortaleciese antes de encomendarle alguna misión de apostolado. A mediados de 1222, ya con buena salud, San Antonio de Padua predicó en la catedral de Forli (sin haber preparado previamente sus palabras, pero con gran profundidad) con ocasión de unas ordenaciones de franciscanos y dominicos.

Su provincial le nombró predicador y le encargó ejercer su ministerio por todo el norte de Italia, donde se extendía por muchos lugares el catarismo. Recorrió así, enseñando, numerosos lugares. Su labor catequética en Rímini en 1223, por ejemplo, fue difícil, pero sus exhortaciones y discusiones públicas acabaron teniendo éxito, logrando convertir entre otros a Bononillo, obispo cátaro. A finales de este año o principios de 1224 estuvo también en Bolonia, enseñando teología a otros frailes franciscanos en el convento de Santa María de la Pugliola; fue el primer maestro de la orden, recibiendo para ello el permiso de San Francisco, que le escribió una carta llamándole "mi obispo".

Hacia 1224 o 1225, sus superiores lo trasladaron al sur de Francia, donde los albigenses tenían más fuerza que en Italia. Su método para combatir la herejía consistió en llevar una vida ejemplar, en charlas con los no creyentes y en catequesis para fortalecer la fe de los cristianos. Prosiguió su enseñanza teológica en Montpellier (donde se formaban los franciscanos y dominicos que iban a predicar en la región) y Tolosa (ciudad con fuerte presencia albigense), además de ser guardián del convento de Le Puy-en-Velay (al oeste de Valence y Lyon) y, desde el capítulo de Arlés de 1225, custodio de Limoges. Como tal estableció la residencia de los franciscanos de la ciudad en una antigua ermita benedictina y fundó un convento cerca de Brieve.

A finales de 1225 participó en el sínodo de Bourges, que examinó la situación de la región. San Antonio de Padua señaló a los prelados la necesidad de vivir sencillamente para dar ejemplo; el obispo de Bourges, Simón de Sully, respondió a sus palabras y aplicó en lo sucesivo la reforma de costumbres, ayudándose de franciscanos y dominicos para la evangelización de su diócesis.

La muerte de San Francisco el 3 de octubre de 1226 le obligó a viajar a Asís, como custodio de Limoges, para asistir al capítulo general que debía elegir nuevo ministro general; éste tuvo lugar el 30 de mayo de 1227, siendo elegido fray Juan Parenti. Buen conocedor de la valía de Antonio, le nombró provincial de Romaña. Muy querido por sus frailes, San Antonio de Padua recorrió los lugares de su provincia donde había conventos franciscanos; uno de ellos fue Vercelli, donde predicó en la catedral con gran impacto y conoció al teólogo y canónigo regular Tomás Galo.

También por entonces debió estar durante estancias largas en Padua, donde fundó una escuela de franciscanos y comenzó a escribir una serie de sermones. Fruto de su labor fue el aumento de las misiones de predicación y la fundación de numerosos conventos. En el capítulo general de 1230, reunido con ocasión del traslado de los restos de San Francisco a su basílica de Asís, pidió a Parenti que le retirase el cargo, a causa de su mala salud.

El general aceptó su renuncia a cambio de formar parte de una comisión que debía presentar al papa Gregorio IX varias cuestiones sobre la regla franciscana que el pontífice debía estudiar y aprobar. Ante él y la curia romana predicó por entonces Antonio, siendo escuchado con entusiasmo: el papa lo llamó "Arca del Testamento". Es posible que colaborase en la redacción de la bula Quo elongati, respuesta a los problemas planteados por la orden al pontífice.

Después marchó al que sería su último destino, Padua, en la que se entregó con tal ardor que en lo sucesivo a su nombre quedaría asociado el de la ciudad: Antonio de Padua. Se instaló primero en la capilla de la Arcella, junto al convento de clarisas, pero solía predicar en el convento franciscano de Santa María, extramuros de la ciudad.

San Antonio de Padua escribió, por petición del cardenal Rinaldo Conti (el futuro Alejandro IV), una serie de sermones según las fiestas del año litúrgico y predicó hasta el agotamiento la Cuaresma de 1231; a sus sermones diarios asistió gran parte de la ciudad y consiguió del Consejo Mayor de la ciudad la liberación de los deudores presos por no tener medios con qué pagar sus deudas (origen del "Estatuto de San Antonio"). Poco después, el podestá Esteban Badoer le rogó que solicitase al poderoso Ezzelino IV da Romano la liberación de varios nobles paduanos que tenia prisioneros; de este modo, viajó a Verona y se entrevistó con Ezzelino, aparentemente sin éxito, si bien unos meses después de la muerte de Antonio acabaría por ceder.

En mayo, habiendo empeorado su salud por el viaje, se retiró al cercano lugar de Camposampiero para descansar y terminar de escribir los Sermones. Pero la gente tuvo conocimiento del lugar en que estaba y acudió en masa a oírle y pedirle consejo. El viernes 13 de junio sufrió un colapso y, ante el próximo fin, pidió que le trasladasen a Padua. Así se hizo, aunque para evitar las multitudes se detuvieron en la Arcella, donde murió Antonio esa misma tarde tras recibir la extremaunción y recitar los salmos penitenciales. No tenía aún cuarenta años, y había ejercido su intensa predicación poco más de diez.

Orador sagrado, fundador de hermandades y de cofradías, teólogo y hombre de gobierno, San Antonio de Padua dejó varios tratados de mística y de ascética; todos sus sermones fueron publicados. Un año después de su muerte fue canonizado, y su culto, muy popular, se generalizó a partir del siglo XV. Su representación más valiosa se debe a Goya, quien lo plasmó en los frescos de la Ermita de San Antonio de la Florida. Fue proclamado doctor de la Iglesia en el año 1946 por el papa Pio XII; su fiesta se celebra el 13 de junio.